1．固相載體的選擇
載體的種類很多，其中包括纖維素、交聯(lián)右旋糖酐、葡萄球菌聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。從使用形式上可有凹孔平板、試管、珠粒等。
聚苯乙烯凹孔板是應(yīng)用zui廣泛的一種載體。聚苯乙烯塑料微量滴定板吸附蛋白的性能好，操作簡便、用量小，適于大批檢查。
由于聚苯乙烯的工藝過程不夠穩(wěn)定,造成各批次差異較大。所以進(jìn)行ELISA之前，必須進(jìn)行篩選。
檢查方法：
⑴ 吸附性能的檢查：先加抗體包被，然后加入同一稀釋度的酶標(biāo)抗體，zui后加底物、顯色、測OD值,求出總平均OD值,再求出每相鄰兩孔的OD平均值,此均值在總均值的±10%以內(nèi)為合格,若中間孔與四周孔OD值相差太大，或一側(cè)與另一側(cè)孔OD值相差較大均屬不合格。
⑵ 對比測定陽性血清與陰性血清，觀察是否存在明顯差異，若二者OD值相差于10倍以上者為合格。
板的處理。新板一般不用處理,用蒸餾水沖洗即可應(yīng)用。板用一次即廢。但不少實驗工作者認(rèn)為用超聲波處理，清潔液Tritonx100、20%乙二醇處理仍可應(yīng)用。但發(fā)現(xiàn)空白對照顯色較深和陽性樣品顯色結(jié)果不理想時，應(yīng)棄去不用。
2．載體的吸附條件
載體的吸附均為物理吸附。吸附的多少取決于PH值、溫度、蛋白濃度、離子強(qiáng)度以及吸附時間等。
較好的吸附條件是：離子強(qiáng)度為0.05Mol/L～0.10Mol/L，pH9.0～pH9.6碳酸鹽緩沖液，蛋白濃度為1μg/ml~100μg/ml，4℃過ye或37℃3h。
3．酶標(biāo)抗體使用濃度的確定
于聚苯乙烯板孔中加足夠量的抗體包被,溫育一定時間，沖洗、把酶標(biāo)結(jié)合物倍比稀釋，每個稀釋度加2孔,溫育、沖洗、再加底物顯色、比色。以O(shè)D值為縱坐標(biāo),酶標(biāo)結(jié)合物的稀釋度為橫坐標(biāo)，制作曲線。找出OD值為1時，相對應(yīng)的酶標(biāo)抗體稀釋度為zui適酶標(biāo)抗體稀釋度。
這個稀釋度是指在這種條件下的zui適稀釋度，換個條件就不是zui適的了。如1：400的酶標(biāo)抗體稀釋度溫育6h可與1：6 400稀釋度溫育24h結(jié)果相同。所以一旦條件確定之后，就不要變更，以保證結(jié)果的重復(fù)性和相對的準(zhǔn)確性。
此zui適酶標(biāo)抗體稀釋度可做為工作濃度，也可提高半個至一個滴度，但不能提高過高，否則非特異性顯色增加。
酶標(biāo)抗體的滴度反映酶標(biāo)抗體的質(zhì)量，也可以此比較酶標(biāo)結(jié)合物的優(yōu)劣。有材料報道認(rèn)為1：320滴度為合格,1：1 000以上更好。酶標(biāo)抗體滴度越高，用于工作濃度的稀釋倍數(shù)就越大，敏感性就越高，非特異性反應(yīng)就越低。
4．抗原：
⑴ 抗原的要求：
用于ELISA的抗原必須采用相當(dāng)純的抗原，如果含有其它雜質(zhì)，將與抗原共同競爭固相載體上的有限位置。用于其它血清學(xué)反應(yīng)的抗原不一定能適用ELISA實驗，必須經(jīng)過試驗，抗原必須能牢固地吸附于載體上，而不喪失其免疫活性，且可得到有規(guī)律的重復(fù)的結(jié)果。另外在吸附載體后，對加入的各種試劑產(chǎn)生zui小的非特異性吸附，即與陰、陽性血清結(jié)合差異較大。
⑵ 抗原效價的測定 可采用單方陣或雙方陣試驗。①單方陣試驗：以不同稀釋度的抗原包被酶標(biāo)板，以常規(guī)的1：200倍稀釋的陽性血清加入，再加入酶標(biāo)抗體、顯色、測OD值，以O(shè)D值為1.0時，相應(yīng)的抗原濃度作為使用效價；②雙方陣試驗比較，它既能測出抗原的zui適濃度又能測出抗體的zui適濃度。即將抗原抗體均稀釋成不同濃度進(jìn)行酶標(biāo)抗體反應(yīng)，以血清稀釋倍數(shù)zui高的陰、陽性血清的光吸收值差zui大的所對應(yīng)的抗原稀釋度為抗原的使用效價。
已吸附的抗原的固相載體經(jīng)凍干或干燥保存很穩(wěn)定,數(shù)月仍不失活。
5．清洗液 一般采用0.01Mol/L pH 7.2 PBS吐溫緩沖液
吐溫是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，為非離子型的表面張力物質(zhì),常做助溶劑。吐溫的編號依聚合山梨醇所結(jié)合的脂肪酸種類不同而定。吐溫20是結(jié)合月桂酸、吐溫40是結(jié)合棕櫚酸、吐溫60是結(jié)合硬脂酸,吐溫80是結(jié)合油酸等。通常用吐溫20加入緩沖液內(nèi)做為濕潤劑,以減少非特異性吸附。也可在PBS緩沖液中加入1%牛血清白蛋白(或10%小牛血清或卵清蛋白),特別在抗原包被以后,以牛血清白蛋白緩沖液再包被一次,而占據(jù)孔內(nèi)剩下位置,這樣來減少非特異性反應(yīng)。
6．反應(yīng)時間
抗原與抗體、抗體與酶標(biāo)抗體反應(yīng)一般在37℃ 2h～3h達(dá)到高峰。時間太短,敏感性下降,時間太長,吸附的抗原或復(fù)合物(在這個溫度下)可能脫落。
7．抗體
抗體效價的測定同抗原,采用雙方陣試驗。
酶底物反應(yīng)時間的確定：一般采用15min～30min～45min。也可以標(biāo)準(zhǔn)陽性血清為準(zhǔn),隨時測定其OD值,當(dāng)達(dá)到規(guī)定的OD值時,即終止反應(yīng)。
