ELISA 是一種敏感性高、特異性強、重復(fù)性好的實驗診斷方法，由于其試劑穩(wěn)定、易保存、操作簡便、結(jié)果判斷較客觀等因素，以及既適宜于大規(guī)模篩查試驗又可以用于少量標本的檢測，既可以做定性試驗也可以做定量分析等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于微生物學、寄生蟲學、腫瘤學和細胞因子等領(lǐng)域。

一、原理

    PCRELISA是用免疫學方法檢測PCR產(chǎn)物，這比常規(guī)用電泳方法及Southernblot要簡便、省時，可同時處理大量標本，便于自動化。PCR-ELISA的原理是在做PCR擴增時應(yīng)用生物素（biotin）標記的引物，這樣PCR的產(chǎn)物就可結(jié)合到親和素（avidin）包被的塑料板上，再用地高辛標記的探針與PCR產(chǎn)物雜交，然后就可以用抗地高辛的酶聯(lián)反應(yīng)檢測。

 

二、材料、方法和結(jié)果

    1.PCR擴增按基本PCR技術(shù)做DNA擴增，只是所用的引物至少有一個是5′端用生物素標記的。通常可在DNA合成儀上直接合成5′端帶生物素標記的引物。

    2地高辛標記的探針雜交將地高辛標記的DNA探針01μg稀釋于90μl 50mmol/L TrisHCl,pH值83,80mmol/L KCl中。取10μl PCR產(chǎn)物加到管中，加熱至90℃，緩慢冷卻至67℃。離心1s，置52℃水浴保溫1h。

3將雜交產(chǎn)物固定到塑料板上①可用商品供應(yīng)的親和素包被的酶標板，亦可用普通酶標板按常規(guī)方法將親和素包被上；②每孔加100μl封閉液（含10mg/ml BSA,1mg/ml魚精DNA的PBS），室溫1h；③PBST洗3次；④將地高辛探針雜交的PCR產(chǎn)物直接加到酶標板上，室溫孵育1h；⑤PBST洗3次。

4ELISA檢測①將抗地高辛抗體稀釋于PBS中，每孔加100μl，室溫孵育1h；②PBST洗3次；③將酶標的第二抗體稀釋于PBS中，每孔加100μl，室溫孵育1h；④PBST洗3次；⑤每孔加100μl酶底物，在顏色適合后終止反應(yīng)；⑥在酶標儀上讀結(jié)果。

 

三、注意事項

    本法的敏感性可與放射性同位素標記相比，但又避免了同位素的危險。做大量樣品時，應(yīng)統(tǒng)一配制反應(yīng)液，再小心地分裝到各反應(yīng)管中，以免污染，并使各管條件一致。非特異性反應(yīng)常由于地高辛標記的DNA探針與酶標板直接結(jié)合所致，因此在封閉液中一定要包括足量的魚精DNA。